Lactobacillus Reuteri: Fonksiyonel özellikleri ve probiyotik olarak kullanımı

Lactobacillus reuteri probiyotikler, beslenme yoluyla belirli sayıda alınması durumunda temel beslenme etkilerine ek olarak, vücuda sağlık açısından yararları olan canlı mikroorganizmalar olarak tanımlanmaktadırlar (Anonymous, 2001b).

İ. Erdem Tonguç, Oktay Yerlikaya, Prof. Dr. Özer Kınık (Ege Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Süt Teknolojisi Bölümü)

GİRİŞ

1907 yılında Nobel ödülü sahibi Elie Metchnikoff, insanların yoğurt ve peynir gibi süt ürünlerini tüketerek vücuda yararlı mikroplar aldığını ilk olarak iddia eden kişidir (Casas and Dobrogosz, 2000). Günümüzde ise probiyotiklerin nasıl çalıştığına, vücuda nasıl ve ne gibi yararları olduğuna dair yapılan birçok bilimsel çalışma sonucu, probiyotik mikroorganizmaların bağışıklığı güçlendirici, kanser riskini düşürücü, sindirim sisteminin sağlığını koruyucu, hastalıklardan iyileşme sürecini hızlandırıcı etkilere sahip oldukları birçok in vitro ve in vivo çalışmalarla belirlenmiştir (Anonymous, 2001b).

LACTOBACİLLUS REUTERİ’NİN TAKSONOMİSİ VE TANILANMASI

Lb. Reuteri, “laktik asit bakterileri” grubunun bir üyesidir. Laktik asit bakterileri (LAB) tanımı, içinde birçok tür bulunduran geniş bir genus topluluğunu kapsar. Genel olarak LAB, mikroaerofilik ile tam anaeorobik şartlar arasında spor oluşturmayan ve çoğunlukla Gram (+) ve katalaz (-) olarak kabul edilirler. Laktik asit bakterileri, insan ve hayvanların GI bölgelerinde ve fermente gıdalarda bulunurlar. Bu laktik asit bakterileri tipik olarak kemoorganotropiktirler ve karbonhidratları fermente ederek son ana ürün olarak laktik asit üretirler. Ön koşul olarak gastrointestinal bölgede canlılıklarını sürdürebilme ile birlikte bazı fizyolojik özellikleri bu bakterilerin probiyotik olarak kullanılmaları açısından ilgi ve araştırma konusu yaratmaktadır. Bu olgu büyük ölçüde düşük pH’ya ve/veya safra tuzlarına olan dayanıklıklarına ve gelişme sıcaklığı aralıklarına bağlıdır. Ancak bu özellikler taksonomik değerlendirme açısından çok büyük bir önem taşımazlar.

Taksonomik değerlendirme açısından önemli olan fizyolojik özellikler karbonhidratları fermente etme yolları, farklı tuz konsantrasyonlarına dayanıklılık özellikleri, farklı besin ortamında gelişebilme özellikleri, belirli sıcaklıklarda gelişebilme yetenekleri ve antibiyotiklere karşı olan dayanıklıklarıdır. Laktobasillerin taksonomisi yıllardır bu fenotipik özelliklere dayanarak düzenlenmektedir. LAB gelişme sıcaklıkları ve heksoz fermentasyonu yollarına (heterofermentatif ve homofermentatif) göre üç ana gruba ayrılmıştır. Modern moleküler yöntemler bu alt gruplara ait türlerinin filogenetik ilişkileri ile tutarsızlık gösterdiğini ortaya koymuştur. Bu yeni moleküler temelli gruplama Hammes ve Vogel (1995) tarafından derlenmiş ve Çizelge 1’de klasik gruplama sistemi ile birlikte özetlenmiştir. Araştırmacılar laktobasilleri sınıflandırırken bakterilerin hücre duvarlarının peptidoglikan yapısını ve pentoz ve heksozları fermente etme yollarını baz almışlardır (Klein et al., 1998).

Son yıllara kadar L. reuteri yanlış sınıflandırılarak Lactobacillus fermentum olarak tanımlanmıştır. Sınıflandırılmaya yönelik şüpheler ancak 1970’li yıllarda ortaya çıkmıştır. Kandler ve ark. daha önce Reuter, Lerche ve Reuter tarafından Lactobacillus fermentum biotip II olarak tanımlanan suşun, çeşitli fenotipik ve genetik özelliklerine dayanarak diğer L. fermentum biotiplerinden belirgin bir şekilde farklı olduğunu göstermiştir. Araştırmacılar L. fermentum biotip II’nin (Gerhard Reuter’in adına dayanarak) L. reuteri adıyla ayrı bir tür olarak kabul edilmesini ve insanlardan izole edilen Reuteri DSM 20016 suşunun belirleyici tür olarak adlandırılmasını önermişler, 1980 yılından beri Lactobacillus genusu içerisinde ayrı bir tür olarak sınıflandırılmıştırlar. (Casas and Dobrogosz, 2000).

LACTOBACİLLUS REUTERİ’NİN PROBİYOTİK ÖZELLİKLERİ

1. Mideden Geçiş ve Gastrointestinal Bölgede Kolonizasyon

L.reuteri gastrik asit ve safra tuzlarına karşı yüksek derecede dayanıklılık gösterir. Bu özelliği mideden geçip gastrointestinal bölgede koloni oluşturabilmesine imkân sağlar. L. reuteri’nin tutunma yüzeyleri açısından güçlü bir kolonileşme özelliğine sahip olduğu kanıtlanmıştır. Yapılan deneyler sonucunda, L. reuteri tüketen gönüllü deneklerin Gİ bölgelerinde etkili bir L. reuteri kolonileşmesi gözlemlenmiştir. Bu sonuçlar ayrıca, dışkıda ölçülen organizma miktarına dayanarak, uzun süreli kolonileşmenin gerekli miktarda probiyotiğin düzenli olarak alınmasıyla mümkün olabileceğini ortaya koymuştur.

Yapılan çalışmalar L. reuteri’nin test edilen 19 tür arasından yetişkin insan intestinal mukozasında kolonileşme yeteneğine sahip 5 türden biri olduğunu ve bu kolonileşen L. reuteri türlerinin de mukozaya özgü çok özel suşlar olduğunu ortaya koymuşlardır.

L.reuteri fibronektin ve kolojenleri (gastrointestinal bölgeler dâhil insan ve hayvan dokularına dağılmış proteinler) bağlayıcı hidrofobik yüzey proteinlerine sahiptir. L. reuteri’nin kolonizasyon ve adhezyon özellikleri, türün gastrointestinal bölgede yarışmacı özellikleri etkisiyle potansiyel patojen bakterileri engelleyici etkisi olduğunu göstermektedir.

L.reuteri’nin insan ve hayvan gastrointestinal bölgelerinde tam olarak hangi bölgelerde kolonileştiklerine ilişkin belirli bir ekolojik çalışma bulunmamaktadır. Oral yollarla farelere, tavuklara, hindilere ve domuzlara verildiğinde sindirim sisteminin hemen hemen her bölgesinde kolonileşme olduğu gözlemlenmiştir.

L.reuteri (DSM 12246), aralarında ticari kültürlerde de bulunan 47 laktobasil türü arasında probiyotik özelliklerinden dolayı ilgi çekmektedir. Bu ilginin kaynağı insan gastrointestinal bölgesini kolonize edebilme yetenekleridir. In vitro çalışmalar L. reuteri’nin;

• pH 2,5 ve % 0,3 safra tuzuna dayanıklılık,
• intestinal hücre bloğuna güçlü tutunma yetenekleri ve
•  enterik patojenik bakterilere karşı antimikrobiyal etkisinin yanında normal gastrointestinal mikroflorasına karşı böyle bir etkilerinin olmadığını ortaya koymuştur.

Yukarıda bahsettiğimiz 47 laktobasil türünden 5 tanesi bu in vitro gereksinimleri karşılayabilmiş, bunlardan reuteri’nin de dâhil olduğu ancak 3 tanesi in vivo koşullarda canlılıklarını sürdürebilmişlerdir. Ayrıca tüm bu türler arasında Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri ve Yersinia enterocolitica gibi patojen bakterilere karşı en etkili antimikrobiyal etkiyi L. reuteri göstermiştir (Casas and Dobrogosz, 2000) .

2. Lactobacillus reuteri’nin Fizyolojik Özellikleri

Laktobasiller karbonhidratları fermente etmek için izledikleri metabolik yola göre üç ayrı gruba ayrılırlar. Zorunlu homofermentatif gruba dahil olan (ör., L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus, L. salivarius ) bakteriler fruktoz disfosfat (FDP) aldolaz yolu izleyerek glikolitik dönüşüm sonucu şekerleri büyük oranda laktik asite dönüştürürler. Fakültatif heterofermentatif grup (ör., L. casei, L. curvatus, L. plantarum, L. sake, L. rhamnosus) bakterileri hem bu FDP aldolaz yolunu hem de fosfoketolaz yolunu indirgeyerek diğer şekerleri fermente edebilirler. L. reuteri üzerinde son on yıl boyunca yapılan çalışmalar sonucunda özellikle sağlığa yararlı etkileri olduğu saptanmış ve üzerinde daha ileri klinik çalışmalar yapılması gerektiği gerçeği ortaya çıkmıştır. L. reuteri gliserol bulunan ortamda anaerobik gelişim süresince geniş aktivite aralığına sahip olan “reuterin” (3-hidroksi-propionaldehit) adı verilen bir antimikrobiyal madde üretir. Reuterin’in antimikrobiyal etkinliği Gram (+) ve Gram(-) bakterileri, mayaları, küfleri, protozoa ve virüsleri kapsar (Casas and Dobrogosz, 2000).

Heterofermentatif bir bakteri olan L. reuteri karbonhidratları laktik aside çevirmesinin yanısıra, asetik asit gibi kısa zincirli yağ asitlerine de çevirir. Böylelikle intestinal pH birçok patojenik bakterinin gelişmesine uygun olmayan bir seviyeye düşer ve antimikrobiyal etki güçlenir.

L.reuteri’nin gastrointestinal floranın diğer üyelerini antagonize edici özelliği reuterin üretimi ile sınırlı kalmaz. Heterofermentasyon ürünleri laktik asit ve asetik asit aynı zamanda antimikrobiyal özellikleri ile de bilinmektedirler. L. reuteri ayrıca H₂O₂ ve bakteriyosinler de üretmektedir (Casas and Dobrogosz, 2000; Yerlikaya ve Kesenkaş, 2009). Yine antimikrobiyal etkiye sahip bir bileşik olan reuterisiklin yakın zamanda tespit ve rapor edilmiştir. Buna paralel olarak, L. reuteri’nin in vitro koşullarda gastrointestinal bölgenin doğal bakteriyel kolonizasyonuna herhangi bir etkide bulunmadan, patojenik bakterilere karşı güçlü bir inhibitör etki gösterdiği belirtilmektedir. SHIME (insan intestinal mikrobiyal ekosistem simulatörü) adı verilen in vitro teknik kullanılarak, bir gecelik süreçte üretilen L. reuteri kültürünün (1.3×10⁹kob) Enterobacteriacae ve koliform populasyonlarını bir log birimden daha yüksek oranda azalttığı tespit edilmiştir (Casas and Dobrogosz, 2000).

Belirli hücre yüzeyi proteinleri (AggH, CnBP ve Mub) L. reuteri’nin hücre yüzeylerinde üretilmektedir (Anonymous, 2001a). Bu proteinler kolonizasyon faktörleri olarak işlev görmekte ve bakterilerin intestinal mukozal hücrelere tutunması ile de ilgili bulunmaktadırlar (Casas and Dobrogosz, 2000; Anonymous, 2001a).  

3. Reuterin Üretimi ve Salgılanması

Reuterin, L. reuteri’nin durağan fazda glikoz, gliserol ve gliseraldehit varlığında ürettiği düşük molekül ağırlıklı bir metabolittir. Etki spektrumu geniş olup bakteri, virüs, fungus ve protozoonları kapsar. Antimikrobiyel etkisinin ribonükleotid redüktaz enzimini inaktive etmesi sonucu oluştuğu düşünülmektedir (Caplice and Fitzgerald, 1999; Yerlikaya ve Kesenkaş, 2009). Ganzle and Vogel (2003) hamur mayasından Lactobacillus reuteri LTH2584 suşunu izole etmişler ve bu izolatın reuterisilin adında bir antibiyotik ürettiğini bildirmişlerdir.

Arques et al. (2004,) reuterin ve nisin’in ayrı ayrı ve birlikte olmak üzere Gram(-) ve Gram(+) gıda patojenlerine etkilerini sütte denemişlerdir. İlgili çalışmada reuterin’in özellikle Campylobacter jejuni üzerine oldukça etkili olduğu belirtilirken (4 log’dan teşhis edilebilir sınırın altına indirmiştir), Salmonella ve diğerlerinde 2-3 log birimlik azalma elde edilmiştir. Nisin ile reuterin arasında antagonistik etkinin gözlenmediği belirtilmektedir. L. monocytogenes üzerine ise antagonistik etki gösterdikleri ve 4 log birimlik azalma sağladıkları, S. aureus’a ise nisin’in reuterin den daha etkili olduğu bildirilmektedir.

Reuterin iki aşamalı bir reaksiyonun ara metaboliti olarak açığa çıkar. Öncelikle gliserol dehitratlanarak reuterin oluşur daha sonra bunun bir kısmı indirgenerek 1,3-propanediol oluşur (Axelsson et al., 1989; Casas and Dobrogosz, 2000).

Reuterin bir dizi kimyasal sentez ve geri doğrulama analizlerini takip eden manyetik rezonans, kütle spektrometre ve kızılötesi analizleri ile izole edilebilir, saflaştırılabilir ve tanılanabilir. Yapılan çalışmalarla 3-hidroksipropanaldehit (3-HPA); monomerik, hidratlanmış monomerik ve siklik dimerik formlarından elde edilen bir denge karışımıdır. 15 ile 30 µg/ml konsantrasyonları düzeyindeki varlıkları, Gram (+) , Gram (-) bakterilerin, küflerin, mayaların ve protozoaların gelişmesini inhibe edici özelliğe sahiptir. Bu değerin 4-5 katı fazla konsantrasyonları L. reuteri’nin kendisi de dâhil olmak üzere laktik asit bakterilerini öldürücü etkiye sahiptir (Casas and Dobrogosz, 2000).

Gliserol’un reuterine dönüşmesini katalizleyen enzim olan, B₁₂ koenzimi bağımlı gliserol dehidrataz, yine reuterini 1,3-propanodiol’e indirgemekle sorumlu, NAD+ koenzimi bağımlı oksidoredüktaz enzimi gibi saflaştırılarak karakterize edilebilir. Bu iki enzim L. reuteri’nin gliserolu karbonhidrat fermantasyonu süresince alternatif hidrojen akseptörü olarak kullanmasına izin vererek mol başına kullanılan substrattan daha fazla ATP elde edilmesini, dolayısıyla büyüme oranının artmasına ve gliserol yokluğunda daha çok biyokütle oluşumunu sağlar. L. reuteri dışındaki türler tarafından 3-HPA geçici bir metabolit olarak üretilir ve derhal 1,3-propanediol’e indirgenir. L. reuteri biyoenerjitik ihtiyaçlarından fazla miktarda 3-HPA üretme özelliği ile kendine özgü bir bakteridir. Bu fazla reuterin mikro çevrede güçlü bir antimikrobiyal etki yaratır (Casas and Dobrogosz, 2000).

Yapılan benzer çalışmalarda, reuterin üretiminin glukoz ve gliserol’un kofermentasyonu süresince baskılandığı tespit edilmiştir. Araştırmacılar reuterin’in UHT sütlerde, cottage peynirlerinde görülebilen Escherichia coli O157:H7 ve Listeria monocytogenes patojenlerini etkili bir şekilde inhibe ettiğini tespit etmişlerdir. Cottage peynirlerine %3 oranında tuz ilavesi L. reuteri’nin bu patojenlere karşı öldürücü etkisini güçlendirmektedir.

4. L. reuteri’nin diğer fizyolojik özellikleri

L.reuteri’nin de dahil olduğu bazı heterofermentatif laktobasiller, glukoz ile kofermentasyonları süresince sitrat kullanarak suksinat üretme yeteneğine sahiptirler. Bazı enzimatik veriler eksik olmasına karşın, bu kofermentasyondaki son ürün yapısı sitrat liyaz ve suksinik asit reaksiyon yoluna işaret etmektedir. Araştırmacılar, yaptıkları çalışmalarda fermente şeker kamışından izole edilen 39 Reuteri suşundan 23’ünün sitrattan suksinik asit ürettiğini belirtmişleridir (Casas and Dobrogosz, 2000). Reuteri’den nikel içeren asit üraz, kısmi olarak saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir.

Ayrıca çeşitli fermentetif bakterileri 5.5 pH da fosfat tamponda bekleterek biyojenik aminlerin yapısı incelenmiştir. Bu çalışmalar bazı Lactobacillus türlerinin çeşitli biyojenik aminler üretme yeteneği olduğu sonucunu göstermiştir. Yine bazı Reuteri türlerinde maltoz fosforilaz aktivitesi tespit edilmiştir. Bunun yanısıra bazı türlerinin de 4,3 ile 6,5 arasında değişen düşük pH seviyelerinde glukoz fermentasyonundan son ana ürün olarak etanol ürettiği tespit edilmiştir. Öte yandan Reuteri’nin herhangi bi ekstraselüler enzimatik aktivite göstermediği ve bunun yanında insandan izole edilen bazı Reuteri suşlarının hidrojen peroksit ürettiği belirlenmiştir (Casas and Dobrogosz, 2000).

5. L. reuteri’nin Antidiyare etkileri

Diyare özellikle çocuk yaşta en çok karşılaşılan rahatsızlıklardan biridir. Akut diyare süresince gastrointestinal mikrobiyota radikal olarak değişir ve Lactobacillus, Bifidobacterium ve Bacteroides türlerinde azalma meydana gelir. Çeşitli araştırmalar Lactobacillus türlerinin bu mikrobiyal dengenin tekrar normalizasyonu sürecini hızlandırdığını ortaya koymuştur. Bunların arasında L. rhamnosus GG’nin çocuklarda rotavirus gastroenteritis hastalığının tedavisinde destek sağlayıcı etki yaptığı ve intestinal immun tepkilerini güçlendirdiği gösterilmiştir (Casas and Dobrogosz, 2000).

a. Terapötik Çalışmalar

Yapılan bir denemede insan anne sütünden izole edilen Reuteri suşları, yaşları 6 ay ile 36 ay arasında değişen %75’i rotavirus kaynaklı akut diyare tedavisi gören hastalara verilmiştir. Hastalar rastgele olarak iki ayrı gruba ayrılmış, 5 gün boyunca günde 10¹⁰ ve 10¹¹ kob’luk dozlarda Reuteri ve plasebo tatbik edilmiştir. Sonuç olarak bu klinik çalışmada Reuteri’nin rotavirus kaynaklı akut diyare tedavisinde etkili bir terapötik bir ajan olarak etkili olduğu belirlenmiştir.

Yapılan paralel bir çalışmada 6 ay ile 36 ay arası yaşta değişen çocuklara rastgele 3 ayrı gruba ayırarak 10⁷, 10¹⁰ günlük kob’luk dozlarda L. reuteri uygulanmıştır. Yine dışkıdaki düzelme ve benzer olumlu değişikliklere dayanarak yukarıda ifade edilen sonuçlar vurgulanmıştır (Casas and Dobrogosz, 2000).

b. Profilaktik Çalışmalar

Yukarıda belirtildiği gibi, yayınlanmış çeşitli çalışmalar belli probiyotiklerin çocuk ishalleri üzerinde güvenli ve biyoterapötik özellikleri olduğunu ortaya koymuştur. Ancak probiyotiklerin bu özelliklerini değerlendiren yayınlanmış kontrollü klinik bir çalışma mevcut değildir. Meksika’da yapılan bir çalışmada iki proje birleştirilerek Reuteri’nin çevresel kaynaklı diyareye karşı olası engelleyici etkisi araştırılmış, bu amaçla 12 ile 36 ay arası 243 bebeğe 14 hafta boyunca plasebo ve içinde Reuteri’de bulunan probiyotik bir karışım verilmiştir. Reuteri ile beslenen çocuklarda 14 hafta boyunca, plasebo verilen bebeklere oranla daha az ishal vakası görüldüğü tespit edilmiştir. Bu projenin ikinci bölümünde 16 hafta boyunca üç gruba ayrılan 310 çocuk üzerinde çalışmalar yapılmıştır. İlk grup olan plasebo grubuna günlük beslenmelerine ek olarak sadece 120 ml’lik dozlarda tam yağlı süt verilmiştir. İkinci gruba Biogaia Laboratuarlarında geliştirilen probiyotik bir karışım içeren (L. reuteri 1.5×10⁷ kob/gr, L. acidophilus 3.6×10⁸ kob/g ve Bifidobacterium infantis 5.1×10⁸ kob/g) kültür ilave edilmiş yine aynı miktarda süt verilmiştir. Üçüncü grup ise Chr. Hansen laboratuarlarında geliştirilmiş (L. acidophilus 3.2×10⁸ kob/gr ve Bifidobacterium infantis 1.1×10⁹ kob/gr) karışık kültür çocuklara uygulanmıştır. Plasebo grubu ile karşılaştırıldığında Reuteri içeren grupta diyare vakalarında belirgin bir düşme gözlemlenirken, Reuteri içermeyen diğer grupta ise Reuteri içeren grup kadar olmasa da yine diyare vakalarında düşme gözlemlenmiştir (Casas and Dobrogosz, 2000).

6. İmmun Sistemin Düzenlenmesi

L.reuteri ATCC 55730 (SD2112) suşu üzerinde ayrıntılı araştırmalar yapılmış ve bu çalışmalarda özellikle bu bakterinin insan gastrointestinal bölgesi sağlığını güçlendirecek ve destekleyecek bir gıda katkı maddesi olarak kullanılması düşünülmüştür. Bu amaçla oral yollarla verilen L. reuteri suşlarının Gİ bölgede koloni oluşturmasının gıda güvenliği açısından hiçbir sakıncası bulunmadığı tespit edilmiş ve Reuteri’nin bu bölgede farklı sebeplerden oluşan diyare vakalarının sıklığını ve şiddetini azalttığı, gastrointestinal hastalık ve enfeksiyonları azalttığı ve daha yaşlı vakalarda kabızlığı önlediği tespit edilmiştir. Yapılan çalışmalarda insan bağırsağında in situ şartlarda L. reuteri’nin GI bölgeyi immunomodüle edici etkisi olabileceği kanıtlarla ileri sürülmüştür. GI bölgede oluşan Salmonella enterica koloni seviyesi, L. reuteri alımından sonra belirgin bir şekilde düşmüştür. Buna paralel yapılan çalışmalarda L. reuteri ATCC 55730 suşunun bağırsak bölgesinde T-yardımcı hücreleri uyararak simbiyotik etkiyi arttırdığını ve dolayısıyla bu bölgenin bağışıklık özelliklerini güçlendirdiğini, bu açıdan probiyotik etki açısından anahtar bir role sahip oldukları öne sürülmüştür (Valeur et al., 2004).

Ayrıca kolon kanserinin gelişmesini etkileyen faktörlerden biri olarak gösterilen bakteriyel safra tuzu hidrolizi ile ilgili yapılan araştırmalarda SHIME testi uygulanarak, L. reuteri’nin safra tuzu sitotoksisitesine karşı bağlayıcı etki yaratarak bu tuzların absorbsiyonunu düşürerek kolon hücre duvarlarına yaptığı zararlı etkiyi azalttığı tespit edilmiştir (Boever et al., 2000) .Buna benzer diğer bir çalışmada ise L .reuteri’nin benzer emilimini etkileyici özelliklerinden dolayı kolesterol seviyesini düşürücü etkiye sahip olduğu vurgulanmıştır (Taranto et al., 1997).

Tüm bunların yanında periodontit (diş çevresi zarının akut yada kronik iltihabı) tedavisinde etkili olarak kullanıldığı da belirtilmektedir (Anonymous, 2010).

L. REUTERİ’NİN GIDA GÜVENLİĞİ VE TOLERANS DÜZEYLERİ AÇISINDAN ÖNEMİ

Buraya kadar sözünü ettiğimiz bilimsel çalışmalar ile Reuteri’nin bulunduğu uygun ortamı kolonize ederek, bulunduğu metabolizmanın belirli mikrobiyolojik, kimyasal ve fiziksel rahatsızlıklara karşı savunma mekanizmasını güçlendirici, geliştirici etkiye sahip olduğunu göstermiştir. Genç sağlıklı bir annenin emzirme döneminde anne sütünden izole edilen L. reuteri suşu kullanılarak yapılan bir dizi klinik deneyler aşağıda özetlenen sonuçları vermiştir.

İlk güvenlik deneyi 1995 yılında Tampere Üniversitesi Hastanesinde Finlandiya’da gerçekleştirilmiştir. Denemelerin amacı;

• Reuteri SD2112 suşunun oral yolla verilmesinin GI bölgeyi kolonize edip etmeyeceğini gözlemlemek,
• Kolonizasyon için gerekli olan dozaj miktarını belirlemek,
• Herhangi ters bir etkinin geçekleşip gerçekleşmeyeceğini gözlemlemek olarak belirlenmiştir.

Bu amaçla hastanenin enfeksiyonel hastalıklar bölümünde yatmakta olan viral ve bakteriyel kökenli enfeksiyon taşıyan, bazıları antibiyotik tedavisi gören ve bazıları görmeyen 6 ila 36 aylık bebek deneklere farklı dozlarda olarak L. reuteri ve plasebo oral yolla verilmiştir. 5 günlük bir denemenin ardından Reuteri alımının herhangi bir ters ya da yan etkisi bulunmadığı ve fekal sayımlara dayanarak hem düşük hem de yüksek dozlar verilen deneklerde bu türün bulunduğu iyi bir kolonizasyon oluşumunun gözlemlendiği bildirilmiştir.

Meksika’da yapılan ikinci bir tolerans/güvenlik ve doz tepkisi/fekal kolonizasyon klinik denemesinde, yaşları 12 ile 36 aylık olarak değişen 72 çocuk rastgele olarak 4 ayrı gruba ayrılarak bu çocuklara plasebo ya da düşük oranda (günde 10⁶ kob), orta düzeyde (günde 10⁸ kob) ve yüksek düzeyde (günde 10¹⁰ kob) dozda L. reuteri, L. acidophilus ve Bifidobacterium animalis türlerini içeren probiyotik içecek verilmiştir. İçeceğin günlük alımı ve tolerans tepkileri hergün gözlemlenmiştir. Bu olası tolerans tepkileri bulantı olayları, karın bölgesinde rahatsızlık, gaz ve dışkı özellikleri olarak belirlenmiş ve toplam laktobasil ve Reuteri fekal sayımları da bu listeye dahil edilmiştir. Çalışma başlangıç, 3 haftalık beslenme süreci ve beslenme sonrası dönemler olarak 3 ayrı aşamada değerlendirilmiştir. Sonuç olarak probiyotik kültürün iyi tolere edildiği, fekal sayımlara dayanılarak iyi bir kolonileşme oluştuğu sonucuna varılmış, ayrıca klinik değerlendirmede 4 farklı grubun istatistiksel olarak birbirlerinden farklı olmadığı ortaya konulmuştur (Casas and Dobrogosz, 2000).

Yaşları 18 ile 75 yaş arası değişen 30 yetişkin üzerinde yapılan klinik deneylerde, deneklere verilen günlük 10¹¹ kob’luk Reuteri dozunun hiçbir güvenlik ve tolerans problemi oluşturmadığı bildirilmiştir. Bu doz alımının, alımın 7. gününden itibaren kolonileşme oluşturduğu ve alımın bitmesinden sonra, en az 7 gün boyunca süreklilik gösterdiği gözlemlenmiştir. Ancak fekal sayım sonuçlarına göre 2 ay sonra kolonizasyon varlığına rastlanamamıştır (Casas and Dobrogosz, 2000).

Güvenlik ve tolerans konularına ilişkin diğer bir klinik deney HIV(+) denekler üzerinde gerçekleştirilmiştir (9). Yaşları 23 ile 50 yaşları arasında değişen 39 yetişkin, AZT kullanmaları veya herhangi bir antiretroviral kullanmamaları dikkate alınmadan iki ayrı uygulama grubuna ayrılmışlardır. Çalışma deneklere plasebo veya günde 10¹⁰ kob Reuteri verilerek ilk 21 günlük doz alımı bunu takip eden 14 günlük dinlenme dönemiyle birlikte toplam 35 gün sürmüştür. Reuteri ve laktobasil seviyelerinin sırasıyla 2 ve 3 log daha düşük tespit edilmiş olmasına rağmen, tüketim sonucunda Reuteri fekal seviyesinin arttığı gözlemlenmiştir. Sonuç olarak bu çalışma günde 10¹⁰ kob’lik Reuteri almının herhangi bir güvenlik ve tolerans sorunu ortaya çıkarmadığını ortaya koymuştur. Bu çalışma ayrıca HIV(+) vakalarında düşük fekal laktobasil seviyesini belirlenmiştir (Wolf et al., 1998; Casas and Dobrogosz, 2000).

 L. REUTERİ’NİN FONKSİYONEL GIDALARDA KULLANIMI

Bir bakteri türünün probiyotik olarak kabul edilmesi için bazı kriterlerin göz önünde bulundurulması gerekmektedir. En azından ticari anlamda üretimini takip eden süreçte canlılığını yüksek oranda koruması önemli bir ölçüttür. Daha önce tüm insan klinik deneylerinde kullanılan Reuteri suşları artık fonksiyonel gıda ürünü bileşeni olarak bulunabilmektedir. Ticari fermentörlerde üretilen Reuteri kültürü buradan alınarak liyofilize veya dondurulmuş preparatlar halinde formülize edilerek ticari kullanıma sunulmuştur. Klinik denemelerde Reuteri kapsüller halinde veya içeceklere veya süt ürünlerine tatbik edilerek fermente ürünler aracılığıyla deneklere verilmekteydi.

Reuteri ilk olarak fonksiyonel gıda marketine 1991 yılında İsveç’te BRA sütü ve BRA fermente sütü adıyla girmiştir. BRA ismi ürünün ihtiva ettiği probiyotik suşlar olan Bifidobacterium animalis, Lactobacillus reuteri ve Lactobacillus acidophilus’un başharflerinden türetilmiştir. Bunu takip eden kısa bir süre sonra İsviçre ve Japonya’da, Reuteri ve diğer probiyotik kültürlerin yanı sıra prebiyotik etkili inülin içeren yoğurt ve yoğurt içeceği formatında, Symbalance adlı ürün tüketicinin beğenisine sunulmuştur. Birçok benzer süt ürünü, meyve suları ve Reuteri içeren diğer gıda ürünleri Finlandiya, ABD ve diğer bazı İskandinav ülkelerinin marketlerinde bulunabilmektedir. Üretim aşamasında ısıl işlem gerektiren bu ürünlerde (UHT süt ve meyve suları), Lifetop adı verilen bir sistemle Reuteri kültürü liyofilize halde ürün şişe kapağının alt kısmına yerleştirilmekte ve şişenin çalkalanması ile kültür içeceğe karışmaktadır.

Bir Japon gıda firması olan Chicyasu da yakın zamanda sade, çilekli ve yaban mersinli çeşitleriyle 80 gramlık ambalajlarda, %8 toplam yağsız kuru madde ve %2,5 yağ oranıyla reuteri kültürü içeren yoğurtlar piyasaya sürmüştür. Ayrıca yine Chicyasu firması kahvaltılarda ve ara öğünlerde diyet desteği olarak tüketilmek üzere L. reuteri kültürü içeren yoğurt içeceği piyasaya sürmüştür.

Bu ürünler canlı Reuteri kültürleri ilave edilerek gıdalarda bulunan doğal koruyucu ve besleyici özelliklerinin yanısıra sağlığı olumlu etkileyecek özellikler kazandırılarak geniş bir fonksiyonel aralığa sahip olmaktadırlar (Casas and Dobrogosz, 2000).

L.reuteri doğal gıdaların yanısıra fonksiyonel gıda sanayiinde farklı ürünler şeklinde piyasaya arz edilmektedir. Birçok farklı şirket, farklı tüketim şekillerinde Reuteri kültürü içeren ürünler üretmektedir. Bunlara örnek olarak içeceklere ve yemeklere karıştırılan Reuteri tozları, Reuteri kapsülleri, çiğneme tabletleri sayılabilir. Yine Finlandiya’da doğal meyve suyuna Reuteri kültürü eklenerek elde edilen probiyotik içecekler de bulunmaktadır.

KAYNAKLAR

Anonymous. (2001a). Physiological properties of reuteri. Biogaia Inc. www.reuteri.com. Anonymous. (2001b). The Intestine- A Vital Barrier to the external enviroment. Biogaia Inc www.reuteri.com.

Arques, J. L., Fernandez J., Gaya P., Nunez M., Rodriguez E. and Medina M. (2004). Antimicrobial activity of reuterin in combination with nisin against food-borne pathogens. International Journal of Food Microbiology, 95, 225-229.

Axelsson, L., Chung, T., C., Dobrogosz, W., J., Lindgren, S., E. (1989). Production of a broad-spectrum antimicrobial substance by Lactobacillus reuteri. Microbiology Ecology in Health and Disease, 2, 131-136.

Boever, P., D., Wouters, R., Verschsaeve, L., Berckmans, P., Schoeters, G., Verstraete, W. (2000).Protective effecet of the bile salt hydrolase-active Lactobacillus reuteri against bile salt cytotoxicity.Applied Microbiology Technology, 53, 709-714.

Caplice, E., Fitzgerald, G. F. (1999). Food fermentations: role of microorganisms in food production and preservation. International Journal of Food Microbiology, 50, 131–149.

Casas, I.A., Dobrogosz, W., J. (2000). Validation of the probiotic concept: Lactobacillus reuteri confers broad-spectrum protection against disease in humans and animals. Microbiolg Ecology in Health and Disease, 12, 247-285.

Ganzle, M.G., Vogel, R.F. (2003). Contribution of reutericyclin production to the stable persistence ofLactobacillus reuteri in an industrial sourdough fermentation. International Journal of Food Microbiology, 80, 31-45.

Hammes, W.P., Vogel, R.F. (1995). The genus Lactobacillus, pp. 19-54. In, B.J.B. Wood and W.H. Holzapfel (Eds). The Genera of Lactic Acid Bacteria. Chapman & Hall, London.

Klein, G., Pack, A., Bonaparte, C., Reuter, G. (1998). Taxonomy and physiology of probiotic lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology, 4, 103-125.

Sharpe, M.E., Fryer, T.F., Smith, D. (1966). Identification of the lactic acid bacteria. In: Identification Methods for Microbiologist, pp. 65-79. Edited by B.M. Gibbs and F.A. Skinner. London, Academic Pres.

Taranto, M., P., Sesma, F., Pesce de Ruiz Holgado, A., Valdes, G., F. (1997). Bile salt hydrolase plays a key role on cholesterol removal by Lactobacillus rueteri. Biotechnology Letters, 19, 845-847.

Valeur, N., Engel, P., Carbajal, N., Connolly, E., Ladefoged, K. (2004). Colonization and immunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the human gastrointsetinal tract. Applied and Enviromental Microbiology, 70, 1176.

Wolf, B., W., Wheeler, K., B.,Ataya, D., G., Garlen, K., A. (1998). Safety and tolerance of Lactobacillus reuteri supplementation to a population infected with the human immunodeficiency virus. Food and Chemical Toxicology, 36, 1085-1094.

Yerlikaya, O., Kesenkaş, H. (2009). Laktik asit bakterilerinin ve fermente süt ürünlerinin antimikrobiyal özellikleri. Hasad Gıda Dergisi, 290, 30-35.